2.1.5.7  臭氧消毒柜
2.1.5.7.1  目  的
    测定臭氧消毒柜(下简称消毒柜)对物体表面上微生物的杀灭效果，以验证其杀菌性能是否符合原设计规定。
2.1.5.7.2  试验器材
    (1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。
    (2) 染菌载体(10mm × 10mm，以布片或玻璃片为代表，必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体)。
    (3) 臭氧采样装置和浓度分析仪。
    (4) 细菌定量杀灭试验用器材( 见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。
    (5) 脊髓灰质炎病毒灭活试验用试液、培养基和器材(见 2.1.1.10 )。
    (6) 温度与湿度计。
2.1.5.7.3  臭氧浓度测定
    (1) 仪器测定:臭氧浓度可用臭氧分析仪测定。操作按仪器使用说明书规定进行。
    (2) 化学滴定法测定:参考本规范理化鉴定实验技术。
2.1.5.7.4 杀灭微生物试验操作程序
臭氧消毒柜的臭氧发生器臭氧发生量一般不可调，故试验时设 3 个作用时间组［时间分组见2.1.1.7.3（1）］。
（1）细菌和真菌杀灭试验
①按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。
   ②因臭氧在柜内扩散慢，分布不易均匀，故物品在柜内应摆放至使用说明书中规定的最高装载量(满载)，以尽量接近实际应用时的情况。
③以 2 片菌片一组，置一无菌平皿中，勿重叠。试验时，将放有菌片的平皿盖打开，分层布放，每层内、中、外各点分别放一组样本。
④按照使用说明书要求，调节柜内温度与相对湿度，并记录备查，然后开启臭氧发生器进行消毒。
    ⑤消毒至规定时间，取出菌片，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。对白色念珠菌的杀灭试验，用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌的杀灭试验，用麦芽浸膏琼脂培养基，其他方法和步骤均与细菌杀灭试验相同。因臭氧气体熏蒸，载体吸收的量少、分解快，可不必进行去除残留臭氧的处理。每组试验重复 3 次。
    ⑥将未消毒的菌片2片，放置于消毒碗柜外室温下。待试验组消毒完毕后，同时进行活菌培养计数检测。取本次试验同批的 PBS 接种培养基培养，作为阴性对照。
    [对未固定装于消毒箱内的臭氧发生器(如冰箱臭氧消毒器)，其杀菌效果鉴定，可按其用途，在相应的密闭柜内进行。柜的大小应与所设计的杀菌有效范围相近]。
（2）脊髓灰质炎病毒灭活试验
    ①按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片为载体。
    ②在消毒碗柜满载的情况下，将干燥的染有脊髓灰质炎病毒的载体置灭菌平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含染有脊髓灰质炎病毒载体的平皿(大型碗柜可在内、中、外各放一平皿)，平皿盖打开。
    ③关闭柜门，开启电源，按原规定程序进行消毒。消毒完毕，按说明书规定的时间，打开柜门，取出平皿。将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度。
④将未消毒的染有脊髓灰质炎病毒的载体 2 片，放置于消毒碗柜外室温下。待试验组消毒完毕后，立即将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度，作为阳性对照。
⑤阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养基有无污染，细胞是否生长良好。
⑥试验重复 3 次。
    ⑦根据各组的平均病毒感染滴度（TCID₅₀ ），分别计算其对病毒的灭活对数值。
2.1.5.7.5  评价规定
    对细菌及其芽孢和真菌，在3次试验中，所设阳性对照组回收菌量在5×10⁵cfu/片～5×10⁶cfu/片，阴性对照无菌生长，试验组中每次试验细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均≥3；对脊髓灰质炎病毒，在 3 次试验中，所设阳性对照组，脊髓灰质炎病毒滴度达 10⁵ (TCID₅₀)，阴性对照细胞无污染，试验组中每次试验病毒滴度下降 4 个对数值者，该组作用时间可作为实验室试验消毒合格的最短作用时间。
若阳性或阴性对照组的结果与上述要求不符，试验作废，重新进行。
2.1.5.7.6  注意事项
    (1) 对试验结果有怀疑时，可在试验时同步进行臭氧浓度测定，以便作进一步的分析。
    (2) 每次试验完毕，应充分排除消毒柜内的臭氧气体，勿使有臭氧残留，以免影响随后的试验。
    (3) 空气中 臭氧 浓度不得超过 0.3mg/m³，臭氧吸入过多，可使人中毒，试验场所应保持通风良好。
    (4) 温度和相对湿度均可影响臭氧气体对细菌的杀灭效果，试验时必须控制好这些条件，使其前后一致。
2.1.5.8臭氧水消毒器
2.1.5.8.1 目的
检测臭氧水消毒器发生的臭氧水消毒剂对物品表面的消毒效果，以验证臭氧水消毒剂对物品表面消毒的实用剂量。
臭氧水消毒剂指应用臭氧消毒设备制备的含臭氧的水溶液，并以其作为消毒剂，用于对物品表面等的消毒。
2.1.5.8.2  试验器材
    (1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。
    (2) 染菌载体(10mm×10mm，以布片为代表，必要时可随消毒对象，增用或改用其他载体)。
    (3) 臭氧采样装置。
    (4) 细菌定量杀灭试验用器材与培养基(见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。
    (5) 脊髓灰质炎病毒灭活试验用试液、培养基和器材(见 2.1.1.10 )。
(6) 温度与湿度计。
(7) 500 ml塑料杯。
(8) 水流量计（1L/min～10L/min）。
(9) 不锈钢网。
(10) 臭氧浓度测定用臭氧分析仪和化学滴定法用试剂、器材等。
2.1.5.8.3 臭氧浓度测定
臭氧浓度的测定方法分为化学滴定法和仪器测定法。
    仪器测定法按仪器使用说明书要求进行。
（1）通过式臭氧消毒设备
测定水样流出消毒设备后臭氧浓度由高到低的衰变曲线。测定时，若出水流量可调，设 3 个流量其中应包括该设备的最大流量和最小流量，若出水流量不可调，则按说明书要求设 1 个流量，各流量水样流出消毒设备后，即刻测定水样中臭氧含量，然后再将水样放 20℃ 水浴中，设 5个～6个时间段，分别测定水样中臭氧含量，并绘制臭氧浓度衰变曲线。
（2）暴气式臭氧消毒设备
测定一定容量的水体中臭氧浓度由低到高，直到臭氧浓度达饱和时的浓度变化曲线。按说明书要求，加入规定容量的水样，通入臭氧气体，设 5个～6个时间段（应测出臭氧浓度达饱和时的最短时间），分别测定水样中臭氧含量，并绘制臭氧浓度变化曲线。
2.1.5.8.4 杀灭微生物试验操作程序
按臭氧设备制备臭氧水消毒剂的方式分为暴气式与通过式两类。
（1）暴气方式臭氧消毒设备制备臭氧水消毒剂的杀灭微生物试验
①按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌黑色变种芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。   
②有专用容器者，按说明书要求向专用容器内加入规定容量的无菌蒸馏水无专用容器者，用容量≥3000ml的烧杯，盛装3000ml无菌蒸馏水样，调水温至20℃±2℃
若无专用容器但需在更大容量的水样中进行试验者，示消毒设备状况，按使用说明书要求调整水样用量，并调水温至20℃±2℃。
③将不锈钢网放盛水容器底部中央，染菌布片放不锈钢网表面，染菌布片上再盖一不锈钢网片。
④连接微孔扩散装置与臭氧气源出口，开启臭氧消毒设备，开始消毒处理。
⑤待臭氧暴气浸泡消毒至规定作用时间（第一个作用时间应不少于水中臭氧达饱和浓度所需时间），取出样片，移入含5 ml中和剂溶液的试管中，中和10 min，进行活菌计菌。
⑥试验同时设阳性对照和阴性对照组，阳性对照用无臭氧气体代替臭氧气体，在水样体积和暴气量等相同条件下，将染菌样片暴气浸泡至最长作用时间，取出样片，进行活菌计数。
⑦试验重复3次。
⑧根据各组杀灭对数值计算结果，确定杀灭细菌繁殖体，真菌或细菌芽孢的杀灭对数值为3所需最低有效浓度和相应的作用时间。
（2）通过式臭氧消毒设备制备的臭氧水消毒剂流动载体浸泡杀灭微生物试验
①按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌黑色变种芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。   
②将臭氧水消毒设备开机5min，使臭氧水中臭氧含量稳定。
③取不锈钢网放盛水容器底部中央，染菌布片放不锈钢网表面，染菌布片上再盖一不锈钢网片。用臭氧水消毒剂沿容器壁流下，流动浸泡消毒至说明书规定作用时间，取样检验。
④试验同时设阳性和阴性对照。阳性对照组用自来水代替臭氧水消毒剂，在相同流量下流动浸泡至最长作用时间。取出样片，进行活菌计数。
⑤取本次试验同批的 PBS 和培养基接种培养基培养，作为阴性对照。
⑥试验重复3次。
⑦根据各组杀灭率计算结果，确定杀灭细菌繁殖体、真菌或细菌芽孢的杀灭对数值为3所需最低有效浓度和相应的作用时间。
2.1.5.8.5 脊髓灰质炎病毒灭活试验
(1) 按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片为载体。
(2) 将制备的脊髓灰质炎病毒玻片加到无菌试管中，使带有病毒的一面向上。
    (3) 将臭氧水消毒设备开机5min，使臭氧水中臭氧含量稳定。
(4) 向含有脊髓灰质炎病毒玻片的试管中加入1.0ml的臭氧水消毒剂，浸泡消毒至规定作用时间，取出玻片载体，移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度。
(5)将未消毒的染有脊髓灰质炎病毒的玻片，加到1.0ml的无菌蒸馏水中，浸泡至规定消毒作用的最长时间。取出玻片载体，移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度，作为阳性对照。
（6）阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养基有无污染，细胞是否生长良好。
(7) 试验重复 3 次。
    (8) 根据各组的平均病毒感染滴度（TCID₅₀ ），分别计算其对病毒的灭活对数值。
2.1.5.8.6  评价规定
对细菌及其芽孢和真菌，在3次试验中，所设阳性对照组的回收菌量在5 × 10⁵cfu/片～5 × 10⁶ cfu/片，阴性对照无菌生长，试验组中每次试验细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均≥3.00；对脊髓灰质炎病毒，在3次试验中，所设阳性对照组，脊髓灰质炎病毒滴度达10⁵ (TCID₅₀)，阴性对照细胞无污染，试验组中每次试验病毒滴度下降4个对数值者，该组作用时间可作为实验室试验消毒合格的最短作用时间。
若阳性或阴性对照组的结果与上述要求不符，试验作废，重新进行。
2.1.5.8.7  注意事项
对试验结果有怀疑时，可在试验时同步进行臭氧浓度测定，以便作进一步的分析。